在Elisa試劑盒檢測中,用什么樣的方法將HRP與抗體球蛋白結合起來呢?恒遠推薦當然不能用強烈的方法,因為強烈的方法會使酶和抗體失去活性。故只能用溫和的方法把酶和抗體結合起來。因此,必須使用結合劑。理想的結合劑應具備下列條件:
(1)不影響酶及抗體活性
(2)不產生干擾物質
(3)抗體和酶結合后應有較高的產量
(4)不出現非特異性反應
(5) 結合程序簡便
(6)來源易、價廉
目前常用的有戊二醛和過碘酸鈉二種。由于對所使用結合劑的針對性,因此標記的方法也有戊二醛交聯法和過碘酸鈉氧化法兩類。
1、戊二醛交聯法:戊二醛是一種能使蛋白質與蛋白質聯結zui常用的雙功能試劑。它有2個對稱的活性醛基,可分別與酶蛋白和免疫球蛋白上的游離氨基(酚基、味唑基、巰基)以共價鍵邊接起來而形成的酶結合物。
過碘酸鈉氧化法:本法是目前酶標記抗體較好的方法,能使70%酶與90%以上球蛋白結合。采用本法首先是用氟代二硝基苯(Fluoro dinitro bengene 2.4—硝基苯,FDNB)封閉HRP表面的游離氨基(亦可用甲醛或戊二醛來封閉),從而提高酶結合抗體球蛋白的能力,避免酶的自身交聯。然后用過碘酸鈉來氧化HRP表面結構的醣鏈部份(即低聚醣基團)使成醛基,使其直接與抗體球蛋白上的游離氨基形成共價鍵而結合。zui后用硼氫酸鈉還原,使HRP表面醛基能充分與抗體球蛋白上氨基進行反應,使之形成穩定的結合物。