什么都能用多聚甲醛固定嗎?

 前言：我們實驗中，標本中大多數神經激素、肽類物質,以及蛋白質為水溶性，在用于研究之前，常需固定,即使其凝固以降低其水溶性。甲醛能與蛋白質的氨基反應，使蛋白質凝固，因此在醫藥上可做檢驗時的組織固定劑、以及防腐劑等。而在固定劑中，zui常用的是多聚甲醛。


多聚甲醛染色前固定：
   做實驗的過程中，因為排不上實驗儀器、希望標本能夠較長時間存放等等原因，很多實驗人員習慣性都會用4％多聚甲醛預先固定標本。也有為了滅活標本里面可能存在的微生物（細菌、病毒等），起到安全保障作用；或者是做胞內染色前的準備，進行固定細胞。


  然而，可能很多人忽視了一點，就是如果在染色之前用多聚甲醛固定標本，細胞表面有些位點在固定后構象發生改變，使得抗體無法結合產生假陰性，也可能由于固定作用，導致其它位點產生非特異性結合（假陽性）。


   因此，知道哪些抗體染色前不能預固定，十分重要。

 

多聚甲醛染色后固定：
   染色后的固定，就與抗原構象關系不大了，更多的是熒光素。以前4色以內的時候，用的熒光素都是非串聯的，因此大多數影響不大，但隨著各種新型串聯染料的出現，多聚甲醛固定就成了問題了。


   事實上，當您去搜索串聯染色標記（如PE-cy7、APC-cy7等）的抗體時，會發現一些比較詳細的描述里面會注明，用多聚甲醛固定過的樣本，必須在4小時內檢測，否則容易導致串聯染料降解，若要長時間保存，還是需要洗滌后，轉移到不含多聚甲醛的緩沖液中。


   需要注意的是，做GFP熒光檢測的同學，也需要注意一下，多聚甲醛固定也會影響GFP，多聚甲醛固定后，并非使GFP熒光淬滅，而是使GFP蛋白構象發生改變，無法產生熒光。有時候您固定后檢測到的熒光可能是自發熒光，或剩余的未被改變構象的GFP發出的。


解決方案：
1、 如果檢測的是前述表格中容易被多聚甲醛影響的分子，請盡量不要預固定，如需長期保存樣本，可以考慮凍存單個核細胞。
2、 如果檢測的是前述表格中不會受多聚甲醛影響的分子，可用1％多聚甲醛固定保存，但FSC、SSC和熒光強度影響較大。
3、 如果希望在染色后保持較長時間熒光穩定，仍建議：避光4度，如果仍不放心，可考慮購買商品化的適用于串聯染料的固定劑。